Noch de moeder noch Zygotic med-1

Noch de moeder noch Zygotic med-1 enkele honderden genen, met inbegrip van

Abstract

De med-1 en med-2 genen coderen voor kleine, zeer gelijkaardige proteïnen gerelateerd aan GATA-type transcriptiefactoren en zijn als nodig is voor de specificatie van zowel de mesoderm en het endoderm van Caenorhabditis elegans voorgesteld. We hebben echter eerder gepresenteerde bewijs dat noch de moeder, noch zygotische expressie van het med-1/2-genen is noodzakelijk om aan te geven de C. elegans endoderm. Tegenspraak onze conclusies, een recent rapport gepresenteerde bewijsmateriaal, gebaseerd op veronderstelde-transgene geïnduceerde co-suppressie, dat de med-1/2 genen een-endoderm specificeren maternale effect inderdaad zien. In dit artikel hebben we opnieuw te onderzoeken med-2 (-); med-1 (-) embryo’s met behulp van een med-2 – specifieke nul-allel in plaats van de chromosomale gebreken eerder gebruikte en bevestigen onze eerdere resultaten: de overgrote meerderheid (~84%) van med-2 (-); med-1 (-) embryo’s express gut korrels. Ook reinvestigate de mogelijkheid van een moeder-med 1/2 effect door directe injectie van dsRNA med in gesensibiliseerde (med deficiënte) hermafrodieten met het standaardprotocol bekend effectief ablatie maternale transcripten zijn, maar weer geen bewijs voor significante maternale voorbeeld med-1/2 effect. We tonen echter aan dat expressie van darm korrels in med-1/2 deficiënte embryo is uiterst gevoelig voor RNAi tegen de vacuolaire ATPase coderende unc-32 gen [aanwezig op hetzelfde multi-med-1 (+) bevattende transgene balancer gebruikt ter ondersteuning van de moederlijke med-1/2 effect]. Wij stellen dan ook dat het experimentele bewijs voor een moeder-med 1/2 effect moet opnieuw worden bezien en kunnen in plaats daarvan weerspiegelen co-suppressie veroorzaakt door meerdere transgene UNC-32 sequenties, niet med sequenties.


Zoals in detail elders (G oszczynski en M c G hee 2005), hadden slechts beperkt succes produceren med-type embryo opgepakt door een van beide protocollen. Met het eerste protocol, waren we in staat om minder dan een gut-korrel-negatieve embryo voor elke twee geïnjecteerd hermafrodieten, die slechts marginaal hoger dan die geproduceerd door injectie van niet-specifieke controle RNA te produceren (zie ook C Oroian et al. 2006). In onze handen, het tweede protocol produceert ofwel steriel moeders of embryo’s die te arresteren voordat het podium waar zij gewoonlijk gut korrels zouden uiten. We gingen dus met een meer definitieve test van de eisen van de med-1/2 genen voor C. elegans endoderm specificatie, het construeren worm stammen scheiden van embryo’s die genetisch zowel med-1 en med-2 zygotische functie ontbrak. In deze stammen, werd de med-1-gen verwijderd door het gen-specifieke deletie ok804; de med-2-gen werd verwijderd door een van de twee chromosomale tekorten, sDf127 of nDf16. beide verwijderen honderden genen, waaronder med-2. Onze resultaten waren onverwacht maar duidelijk: we vonden dat slechts 16-17% of 0-3% van de dubbel homozygote med-2 (null); med-1 (null) embryo’s niet uit te drukken gut korrels (Naargelang sDf127 of nDf16 werd gebruikt om med-2 te verwijderen). Beide schattingen waren veel lager dan de gt; 70% gut-korrel-negatieve embryo’s voorspeld door het oorspronkelijke model van M Aduro et al. (2001). We concludeerde dan ook dat de zygote expressie van het med-1 en med-2 genen een belangrijke noodzakelijke rol in het specificeren van endoderm niet kon spelen. Hoewel med transcripten niet kan worden gedetecteerd in de moederlijke kiembaan (R einke et al. 2004), we toch gezocht naar (maar niet vinden) geen aanwijzingen voor een mogelijke maternale effect van de med-1/2-genen, met behulp van de standaard protocol dsRNA injectie in gesensibiliseerde Med-1/2 deficiënte hermafrodieten. Met hetzelfde protocol zelfs nonsensitized stammen, we routinematig produceren 100% aangehouden embryo’s wanneer de doelgroep de moederlijke SKN-1 gen (G oszczynski en M c G hee 2005) en 100% aangehouden larven wanneer de doelgroep het relatief vroeg zygote gen ELT-2 ( F ukushige et al. 2005).

Twee onopgeloste kwesties gebleven. Ten eerste, wat is de juiste inschatting voor het percentage van gut-korrel-negatieve med-2 (-); med-1 (-) embryo’s? Indien de 16-17% geschat met sDf127-bevattende stam correct is (en dus de 0-3% uitgedrukt met de nDf16 bevattende stam onjuist), kan een “endoderm suppressor” worden geïdentificeerd onder de genen verwijderd nDf16 maar niet door sDf127. Het tweede probleem is dat, in weerwil van onze verdediging van chromosomale gebreken (G oszczynski en M c G hee 2005), het gebruik van gen-specifieke knock-outs voor zowel med-1 en med-2 zou onze conclusie te versterken dat het verlies van de MED 02/01 genen veroorzaakt slechts een zwak impenetrant verlies van endoderm.

De recente beschikbaarheid van een Mos transposon insertie (G ranger et al 2004;.. W illiams et al 2005) in de med-2-gen (allel cxTi9744) een middel om het belang van de med-1/2-genen opnieuw te beoordelen voor het opgeven endoderm zonder een beroep op chromosomale tekortkomingen. Derhalve construeerden wij de twee gebalanceerde spanningen in Tabel 1 beschreven JM142 [med-2 (cxTi9744); + Med-1 (ok804) / lin-2 +)] mist beide kopieën van med-2 (+) maar één kopie van med-1 (+). en JM143 [+ med-2 (cxTi9744) / sma-3 +; med-1 (ok804)] mist beide kopieën van med-1 (+) maar één kopie van med-2 (+). Beide med allelen zijn waarschijnlijk nul te zijn (zie voetnoot a bij tabel 1) en worden hierna kortweg med-1 (-) of med-2 (-). Een kwart van de embryo’s vervaardigd door stam worden med-2 (-); med-1 (-) en moeten stoppen. Deze verwachting wordt nauwkeurig een ontmoeting met stam JM142, maar 42,2% van de embryo’s die door JM143 arrestatie voorafgaand aan het uitkomen, hetgeen duidt op een zekere mate van med-2 haplo-insufficiëntie (semiquantitatively geverifieerd door PCR op gearresteerd embryo’s). Met andere woorden, een embryo met slechts één kopie van elke med gen heeft een hogere kans op overleving als dat één exemplaar med-1 (-100%) dan med-2 (~66%). De morfologie van het embryo aangehouden is gelijk voor beide stammen (figuur 1, A en C): veel van de embryo’s worden aangehouden in de tweevoudige podium met een morfologie zoals oorspronkelijk beschreven door M Aduro et al. (2001); anderen hebben eerder gearresteerd en kan schromelijk worden gevacuoliseerde.

Beelden van gearresteerde embryo’s geproduceerd door (A en B) stam JM142 [med-2 (-); + Med-1 (-) / lin-2 +] en (C en D) stam JM143 [+ med-2 (-) / sma-3 +; med-1 (-)]. In A en C, werden differentiële interferentie contrast optica gebruikt. In B en D, polarisatie optica onthullen dubbelbrekende gut korrels (Z-projectie van 4-5 verschillende focale vliegtuigen). Bar, 50 urn. Gestippelde ellipsen aangeven gearresteerd embryo’s die zijn darmen korrel negatief. Embryo’s geproduceerd door JM143 lijken meer heterogeen (meer dan men verwacht van de waargenomen med-2 haplo-insufficiëntie) en kwetsbaarder dan die geproduceerd door JM142.

De meerderheid (gt; 80%) van med-2 (-); med-1 (-) embryo’s drukken de endoderm marker darm korrels

Figuur 1, B en D. blijkt dat slechts een kleine fractie van de gearresteerde embryo’s die door een van beide stam niet gut korrels uit te drukken, de standaard test voor bepaalde endoderm. Na correctie voor haplo-insufficiëntie (Tabel 1), het percentage darm-granule-negatieve homozygote med-2 (-); med-1 (-) embryo’s wordt geschat op 14,2 en 17,3% voor de twee verschillende stammen, in uitstekende overeenkomst met de 16-17,3% gut-korrel-negatieve med-1/2 deficiënte embryo eerder gemeten scheiden van de sDf127-bevattende stam JM134 (G oszczynski en M c G hee 2005). Zo, onze gecombineerde resultaten blijven onverenigbaar is met het oorspronkelijke model van M Aduro et al. (2001. p. 481), waarin werd voorgesteld om de med-1/2-genen “functie stroomafwaarts van SKN-1 in de EMS afstamming en zijn essentieel voor E (en MS) lot specificeren in welke context.”

Onze laatste schatting van -16% gut-korrel-negatieve med-2 (-); med-1 (-) embryo’s verschilt aanzienlijk van de 0-3% gut-korrel-negatieve med-2 (-); med-1 (-) embryo’s scheiden van de nDf16 bevattende stam JM136 (G oszczynski en M c G hee 2005). Zoals hierboven opgemerkt, dit verschil verhoogt de mogelijkheid dat een potentiële “endoderm suppressor” bevindt tussen de ~413 genen (exclusief microRNA) verwijdert door nDf16 ze niet sDf127. Wij dus gevoed JM134 [dpy-17 sDf127 UNC-32 III; SDP3 (III, f); med-1 (-)] dieren op individuele Escherichia coli stammen die de 290 van deze 413 genen die aanwezig zijn in de Ahringer RNAi bibliotheek (K Amath et al. 2003). Echter, we waren niet in staat om een ​​kloon die het aandeel van de darm-korrel-negatieve embryo’s uit de -16% gezien met sDf127 de zou kunnen verlagen identificeren lt; 3% gezien met nDf16.

RNAi tegen med-1 en med-2 heeft geen significant effect maar RNAi tegen unc-32 verhoogt het percentage darm-granule-negatieve med-2 (-); med-1 (-) embryo

Als het verlies van zowel med-1/2-genen veroorzaakt slechts een zwak penetrant verlies van endoderm en als er geen moeder med-1/2 effect bestaat, wat is de belangrijkste regulerende route opgeven van endoderm? Zoals oorspronkelijk voorgesteld door Z hu et al. (1997) en zoals we eerder hadden opgemerkt (G oszczynski en M c G hee 2005), al het bewijsmateriaal wijst op de SKN-1 transcriptiefactor die de belangrijkste directe rol in het specificeren van endoderm. Vooral M Aduro et al. (2005) hebben aangetoond dat de activiteit van het end-1 promoter (gedacht kritisch betrokken bij endoderm specificatie) wordt sterk verlaagd ( “++++” naar “+”) wanneer een stroomopwaarts gebied met meerdere SKN-1 sites is verwijderd. In tegenstelling, de korte proximale uiteinde-1 promotorgebied dat MED-1/2 plaatsen drijft de laag ( “+”) restgehalte end-1 activiteit.

Dankwoord

Mos insertie-allel, de C. elegans Genetics Center (gefinancierd door het National Center for Research Resources) voor het leveren van verschillende stammen, en Paul Mains (University of Calgary) voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een exploitatiesubsidie ​​van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) naar J.D.M. V.V.C. kreeg gedeeltelijke steun van een CIHR Institute of Genetics training subsidie. J.D.M. is een medische wetenschapper die van de Alberta Heritage Foundation for Medical Research en Canada Research Chair.

voetnoten

Bron: www.genetics.org

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *

zestien − vier =